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MrBayesによる系統樹作成法(BLV envを解析した時のメモ)

仲田様のホームページ

のMrBayes 3.1.2 を用いた系統解析 on windowsを参考にさせていただきました。ありがとうございました。手順だけ載せてますので、詳しい解説は、中田様のホームページやMrBayesのマニュアルを参考にしてください。

<蛋白質をコードするDNA配列の場合>

  1. MrBayes:Bayesian Inference of PhylogenyのページからMrBayesをダウンロードしてインストール。
  2. Clustal Xなどでアライメントを作成し、NEXUS形式で保存。
  3. Editorで作成した.nxsファイルを開けて、symbols=”ABCDEFGHIKLMNOPQRSTUVWXYZ” の行を削除。”interleave”を”interleave=yes”に変更
  4. ファイルの最後に

BEGIN MRBAYES;
charset 1st_pos=1-.\3
charset 2nd_pos=2-.\3
charset 3rd_pos=3-.\3
partition by_codon = 3:1st_pos,2nd_pos,3rd_pos;
set partition = by_codon;
lset nst=6;
prset ratepr=variable;
END;

を挿入し、gene.bayとしてファイルをmrbayes.exeがあるフォルダに保存

begin mrbayes;
log start filename=Gene1.log replace;
mcmcp ngen=10000 printfreq=1000 samplefreq=100
nchains=4 savebrlens=yes filename=Gene1;
mcmc;
log stop;
end;
こうして編集したファイルを mcmc.bay として保存する。

準備が終わったら以下のコマンドを実施

mrbayes.exe

execute  gene.bay

exe mcmc.bay

解析を続行するかどうか聞かれるので、世代を増やして収束するまで続ける。ASDSF値が0.01より低くなるまで。

sump burnin=世代数÷100÷4

->1,2,*がばらついていること。そしてPSRF値が0.9-1.1の間に入っていることを確認。

sumt burnin=世代数÷100÷4

で、系統樹、gene.conが出力される。

FigTreeTreeGraphで系統樹を確認できる。

 

BoLA-DRB3 PCR-SBTによるアリルタイピング法

サンプルについての注意

  • DNA濃度を10~40ng/㎕に調整しておく。
  • 必ずポジティブコントロール、ネガティブコントロールをおくこと。

< PCR> TOYOBO rTaqPolymerase KITを用いる
Primer :
DRB3FRW :CGCTCCTGTGAYCAGATCTATCC
DRB3REV: CACCCCCGCGCTCACC

10×buffer     2.5㎕
2mM dNTP    2.5㎕
25mM MgCl₂   1.5㎕
10pmol/㎕ DRB3FRW  0.75㎕
10pmol/㎕ DRB3REV  0.75㎕
5units/㎕ rTaq  0.2㎕
大塚蒸留水   15.8㎕
ゲノムDNA    1.0㎕
Total       25.0㎕
<PCR condition>
94℃ 2分
94℃ 30秒  ⌉
57℃ 30秒   ¦ ×35
72℃ 1分     ⌋
72℃ 2分
14℃     pause

<電気泳動>
2%アガロースゲル(EtBr) 100V 20分
マーカー:Φ174/HaeⅢ 2㎕
サンプル: PCR product 5㎕ + Lording Buffer 1㎕
<Exo-SAP IT処理> GE ヘルスケア Exo-SAP ITを用いる
Exo mix ….Exo-SAPを5倍に希釈

PCR product   20㎕
ExoSap希釈液 2㎕
Total        22㎕

<PCR condition>
37℃     15分
80℃     15分
4℃     pause
<Cycle sequence用product希釈>
大塚蒸留水 178 ㎕
ExoSap済PCR product 22㎕
Total 200㎕

<Cycle sequence> ABI Big Dye Terminator v1.1を用いる

Primer :
DRB3FRW :CGCTCCTGTGAYCAGATCTATCC
DRB3REV: CACCCCCGCGCTCACC

5×buffer               3.875㎕
Big Dye v1.1             0.25㎕
10pmol/㎕プライマー       0.05㎕
大塚蒸留水            15.025㎕
Cycle sequence用product   0.8㎕
Total                20㎕

<PCR cycle>

96℃ 1分
96℃ 10秒 ⌉
50℃ 5秒     ¦ ×25
60℃ 4分    ⌋
4℃ pause
シークエンス後、Forward sequenceおよびReverse SequenceをConexio社のAssign SBTソフトウェアで解析し、アリルを決定する。

*タイピングの解析については理研・分子ウイルス学特別研究ユニットまでお問合せ下さい。

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