EnsemblのGene IDが得られても、何の遺伝子か調べるのに結構手間が掛かって、たくさんの遺伝子情報から何かものを考えようと思うときに、以外に手間取りました。ヒト・マウス以外では使えないツールばっかりしかなかったので、ウシとかはとくにめんどくさかった、ということで、EnsembleのID listを入れるとSymbolと、その遺伝子のスタートポジションを返してくれるJavascriptを作製してもらいました。個人的な利用なので、あれですが、使ってみたい方はどうぞ。
「遺伝子解析」カテゴリーアーカイブ
ThunderBird(Toyobo)を用いたCoCoMo-qPCRーABI7500Fast版
Thunderbird（Toyobo)を使用してCoCoMo-qPCRを行う場合、検量線のカーブがおかしくなる事例が報告されています。
現在、理研で検討した結果行っているABI7500Fast用プロトコルを掲載します。
<PCR反応液>
2μL CoCoMo-Primer (x10)
3μL CoCoMo Probe
10 µL Thunderbird qPCR Mix
0.04 µL Rox
4.96 μL 検体サンプル
<PCR Cycle>
50℃ 2min (必要ないと思われますが、一応）*2016/7/27修正。このステップはない方がうまくいくようです。
95℃ 20 sec
——–
95℃ 15 sec —①
60℃ 1 min —② :45 Cycle
——-
問題が生じている場合、是非試してみていただけたらと思います。
MrBayesによる系統樹作成法(BLV envを解析した時のメモ）
のMrBayes 3.1.2 を用いた系統解析 on windowsを参考にさせていただきました。ありがとうございました。手順だけ載せてますので、詳しい解説は、中田様のホームページやMrBayesのマニュアルを参考にしてください。
＜蛋白質をコードするDNA配列の場合＞
- MrBayes:Bayesian Inference of PhylogenyのページからMrBayesをダウンロードしてインストール。
- Clustal Xなどでアライメントを作成し、NEXUS形式で保存。
- Editorで作成した.nxsファイルを開けて、symbols=”ABCDEFGHIKLMNOPQRSTUVWXYZ” の行を削除。”interleave”を”interleave=yes”に変更
- ファイルの最後に
BEGIN MRBAYES;
charset 1st_pos=1-.\3
charset 2nd_pos=2-.\3
charset 3rd_pos=3-.\3
partition by_codon = 3:1st_pos,2nd_pos,3rd_pos;
set partition = by_codon;
lset nst=6;
prset ratepr=variable;
END;
を挿入し、gene.bayとしてファイルをmrbayes.exeがあるフォルダに保存
begin mrbayes;
log start filename=Gene1.log replace;
mcmcp ngen=10000 printfreq=1000 samplefreq=100
nchains=4 savebrlens=yes filename=Gene1;
mcmc;
log stop;
end;
こうして編集したファイルを mcmc.bay として保存する。
準備が終わったら以下のコマンドを実施
mrbayes.exe
execute gene.bay
exe mcmc.bay
解析を続行するかどうか聞かれるので、世代を増やして収束するまで続ける。ASDSF値が0.01より低くなるまで。
sump burnin=世代数÷100÷4
->1,2,*がばらついていること。そしてPSRF値が0.9-1.1の間に入っていることを確認。
sumt burnin=世代数÷100÷4
で、系統樹、gene.conが出力される。
Rでベン図作成
Hiroki Otsuka様のページを参考にさせていただきました。ありがとうございます。
install.packages(“VennDiagram”, repos=”http://cran.ism.ac.jp/”) #はじめだけ。インストール
library(VennDiagram)#2回目はここから
pdf(“ファイル名.pdf”)#PDFで出力するとき
draw.triple.venn(
area1 = 45, #エリアAの全数
area2 = 44, #エリアBの全数
area3 = 48+19, #エリアCの全数
n12 = 38, #エリアB+エリアAの数
n23 = 42, #エリアB+エリアCの数
n13 = 44, #エリアA+エリアCの数
n123 = 38, #エリアA+エリアC+エリアBの数（中心の数）
reverse = T, #縦軸での対称変換
rotation = 1, #カテゴリー配置の時計回り回転（デフォルト１）
rotation.degree = 60, #図全体の回転度
lty = c(1,1,1), #線の種類
lwd = c(3,3,3), #線の太さ
cex = 4, #中の字の大きさ
category = c(“gp51”, “p24”, “CoCoMo”), #カテゴリー名
cat.cex = c(3, 3, 3), #カテゴリー名の大きさ
cat.col = c(“blue”, “red”, “green”), #カテゴリー名の色
fill = c(“blue”, “red”, “green”), #それぞれの領域の色
cat.pos = c(225, 0, 144), #カテゴリー名のポジション（角度）
cat.dist = c(0.06, 0.07, 0.08), #カテゴリー名の離れ具合
euler.d=FALSE,
scaled=FALSE,
margin = 0.05 #周囲のマージン
)
dev.off()
q()
BoLA-DRB3 PCR-SBTによるアリルタイピング法
サンプルについての注意
- DNA濃度を10～40ng/㎕に調整しておく。
- 必ずポジティブコントロール、ネガティブコントロールをおくこと。
< PCR> TOYOBO rTaqPolymerase KITを用いる
Primer :
DRB3FRW :CGCTCCTGTGAYCAGATCTATCC
DRB3REV: CACCCCCGCGCTCACC
10×buffer 2.5㎕
2mM dNTP 2.5㎕
25mM MgCl₂ 1.5㎕
10pmol/㎕ DRB3FRW 0.75㎕
10pmol/㎕ DRB3REV 0.75㎕
5units/㎕ rTaq 0.2㎕
大塚蒸留水 15.8㎕
ゲノムDNA 1.0㎕
Total 25.0㎕
<PCR condition>
94℃ 2分
94℃ 30秒 ⌉
57℃ 30秒 ¦ ×35
72℃ 1分 ⌋
72℃ 2分
14℃ pause
<電気泳動>
2％アガロースゲル(EtBr) 100V 20分
マーカー：Φ174/HaeⅢ 2㎕
サンプル： PCR product 5㎕ ＋ Lording Buffer 1㎕
<Exo-SAP IT処理> GE ヘルスケア Exo-SAP ITを用いる
Exo mix ….Exo-SAPを５倍に希釈
PCR product 20㎕
ExoSap希釈液 2㎕
Total 22㎕
<PCR condition>
37℃ 15分
80℃ 15分
4℃ pause
<Cycle sequence用product希釈>
大塚蒸留水 178 ㎕
ExoSap済PCR product 22㎕
Total 200㎕
<Cycle sequence> ABI Big Dye Terminator v1.1を用いる
Primer :
DRB3FRW :CGCTCCTGTGAYCAGATCTATCC
DRB3REV: CACCCCCGCGCTCACC
5×buffer 3.875㎕
Big Dye v1.1 0.25㎕
10pmol/㎕プライマー 0.05㎕
大塚蒸留水 15.025㎕
Cycle sequence用product 0.8㎕
Total 20㎕
<PCR cycle>
96℃ 1分
96℃ 10秒 ⌉
50℃ 5秒 ¦ ×25
60℃ 4分 ⌋
4℃ pause
シークエンス後、Forward sequenceおよびReverse SequenceをConexio社のAssign SBTソフトウェアで解析し、アリルを決定する。
＊タイピングの解析については理研・分子ウイルス学特別研究ユニットまでお問合せ下さい。