EnsemblのGene IDが得られても、何の遺伝子か調べるのに結構手間が掛かって、たくさんの遺伝子情報から何かものを考えようと思うときに、以外に手間取りました。ヒト・マウス以外では使えないツールばっかりしかなかったので、ウシとかはとくにめんどくさかった、ということで、EnsembleのID listを入れるとSymbolと、その遺伝子のスタートポジションを返してくれるJavascriptを作製してもらいました。個人的な利用なので、あれですが、使ってみたい方はどうぞ。
「牛白血病」カテゴリーアーカイブ
ThunderBirdを用いたBLV-CoCoMo-qPCR法
2017.01.05CoCoMo-qPCRプロトコール検討結果rev1
2017.1.21更新しました。初期変性、長めの方が良いようです。
CoCoMo-qPCRを実施する場合の実験条件は試薬量、実施ウェルなどを一覧にしたファイルです。実験をするときに使用して頂けたら便利かと思います。
ThunderBird(Toyobo)を用いたCoCoMo-qPCRーABI7500Fast版
Thunderbird(Toyobo)を使用してCoCoMo-qPCRを行う場合、検量線のカーブがおかしくなる事例が報告されています。
現在、理研で検討した結果行っているABI7500Fast用プロトコルを掲載します。
<PCR反応液>
2μL CoCoMo-Primer (x10)
3μL CoCoMo Probe
10 µL Thunderbird qPCR Mix
0.04 µL Rox
4.96 μL 検体サンプル
<PCR Cycle>
50℃ 2min (必要ないと思われますが、一応)*2016/7/27修正。このステップはない方がうまくいくようです。
95℃ 20 sec
——–
95℃ 15 sec —①
60℃ 1 min —② :45 Cycle
——-
問題が生じている場合、是非試してみていただけたらと思います。
MrBayesによる系統樹作成法(BLV envを解析した時のメモ)
のMrBayes 3.1.2 を用いた系統解析 on windowsを参考にさせていただきました。ありがとうございました。手順だけ載せてますので、詳しい解説は、中田様のホームページやMrBayesのマニュアルを参考にしてください。
<蛋白質をコードするDNA配列の場合>
- MrBayes:Bayesian Inference of PhylogenyのページからMrBayesをダウンロードしてインストール。
- Clustal Xなどでアライメントを作成し、NEXUS形式で保存。
- Editorで作成した.nxsファイルを開けて、symbols=”ABCDEFGHIKLMNOPQRSTUVWXYZ” の行を削除。”interleave”を”interleave=yes”に変更
- ファイルの最後に
BEGIN MRBAYES;
charset 1st_pos=1-.\3
charset 2nd_pos=2-.\3
charset 3rd_pos=3-.\3
partition by_codon = 3:1st_pos,2nd_pos,3rd_pos;
set partition = by_codon;
lset nst=6;
prset ratepr=variable;
END;
を挿入し、gene.bayとしてファイルをmrbayes.exeがあるフォルダに保存
begin mrbayes;
log start filename=Gene1.log replace;
mcmcp ngen=10000 printfreq=1000 samplefreq=100
nchains=4 savebrlens=yes filename=Gene1;
mcmc;
log stop;
end;
こうして編集したファイルを mcmc.bay として保存する。
準備が終わったら以下のコマンドを実施
mrbayes.exe
execute gene.bay
exe mcmc.bay
解析を続行するかどうか聞かれるので、世代を増やして収束するまで続ける。ASDSF値が0.01より低くなるまで。
sump burnin=世代数÷100÷4
->1,2,*がばらついていること。そしてPSRF値が0.9-1.1の間に入っていることを確認。
sumt burnin=世代数÷100÷4
で、系統樹、gene.conが出力される。
Rでベン図作成
Hiroki Otsuka様のページを参考にさせていただきました。ありがとうございます。
install.packages(“VennDiagram”, repos=”http://cran.ism.ac.jp/”) #はじめだけ。インストール
library(VennDiagram)#2回目はここから
pdf(“ファイル名.pdf”)#PDFで出力するとき
draw.triple.venn(
area1 = 45, #エリアAの全数
area2 = 44, #エリアBの全数
area3 = 48+19, #エリアCの全数
n12 = 38, #エリアB+エリアAの数
n23 = 42, #エリアB+エリアCの数
n13 = 44, #エリアA+エリアCの数
n123 = 38, #エリアA+エリアC+エリアBの数(中心の数)
reverse = T, #縦軸での対称変換
rotation = 1, #カテゴリー配置の時計回り回転(デフォルト1)
rotation.degree = 60, #図全体の回転度
lty = c(1,1,1), #線の種類
lwd = c(3,3,3), #線の太さ
cex = 4, #中の字の大きさ
category = c(“gp51”, “p24”, “CoCoMo”), #カテゴリー名
cat.cex = c(3, 3, 3), #カテゴリー名の大きさ
cat.col = c(“blue”, “red”, “green”), #カテゴリー名の色
fill = c(“blue”, “red”, “green”), #それぞれの領域の色
cat.pos = c(225, 0, 144), #カテゴリー名のポジション(角度)
cat.dist = c(0.06, 0.07, 0.08), #カテゴリー名の離れ具合
euler.d=FALSE,
scaled=FALSE,
margin = 0.05 #周囲のマージン
)
dev.off()
q()
CoCoMo qPCRとTaKaRa qPCRのコスト比較
現在購入可能な牛白血病検査用BLVプロウイルス定量試薬のコスト比較
ToyoboのThunderbirdリアルタイムPCR用試薬を用いた場合のCoCoMo-qPCRのコスト
牛白血病関係リンク
放牧に関するリンク
日本草地畜産種子協会
牛白血病について
牛白血病研究を行っている大学・研究機関
牛白血病検査試薬・診断薬
動物用診断薬
- 牛白血病エライザキット(JNC株式会社)
- CoCoMo-BLV検出キット(理研ジェネシス)
- 牛白血病抗体アッセイキット「日生研」(日生研)
検査用試薬
- ウシ白血病ウイルス検出用Probe/Primer/Positive control(タカラバイオ)
- BLV-CoCoMo-qPCR(理研ジェネシス)