サンプルについての注意

• DNA濃度を10～40ng/㎕に調整しておく。
• 必ずポジティブコントロール、ネガティブコントロールをおくこと。

< PCR>　TOYOBO rTaqPolymerase KITを用いる
Primer :
DRB3FRW :CGCTCCTGTGAYCAGATCTATCC
DRB3REV: CACCCCCGCGCTCACC

10×buffer 　　　　2.5㎕
2mM dNTP 　　　2.5㎕
25mM MgCl₂ 　　1.5㎕
10pmol/㎕ DRB3FRW 　0.75㎕
10pmol/㎕ DRB3REV 　0.75㎕
5units/㎕ rTaq 　0.2㎕
大塚蒸留水 　　15.8㎕
ゲノムDNA 　　　1.0㎕
Total 　　　　　　25.0㎕
<PCR condition>
94℃ 2分
94℃ 30秒  ⌉
57℃ 30秒   ¦ ×35
72℃ 1分     ⌋
72℃ 2分
14℃　　　　　pause

<電気泳動>
2％アガロースゲル(EtBr) 100V 20分
マーカー：Φ174/HaeⅢ 2㎕
サンプル： PCR product　5㎕　＋　Lording Buffer 1㎕
<Exo-SAP IT処理> GE ヘルスケア　Exo-SAP ITを用いる
Exo mix ….Exo-SAPを５倍に希釈

PCR product 　　20㎕
ExoSap希釈液　2㎕
Total 　　　　　　　22㎕

<PCR condition>
37℃　　　　　15分
80℃　　　　　15分
4℃　　　　　pause
<Cycle sequence用product希釈>
大塚蒸留水 178 ㎕
ExoSap済PCR product 22㎕
Total 200㎕

<Cycle sequence>　ABI Big Dye Terminator v1.1を用いる

Primer :
DRB3FRW :CGCTCCTGTGAYCAGATCTATCC
DRB3REV: CACCCCCGCGCTCACC

5×buffer　　　 　　　　　　　　　　　3.875㎕
Big Dye v1.1 　　　　　　　　　　　　0.25㎕
10pmol/㎕プライマー　　 　　　　0.05㎕
大塚蒸留水 　　　　　　　　　　　15.025㎕
Cycle sequence用product　 　0.8㎕
Total 　　　　　　　　　　　　　　　20㎕

<PCR cycle>

96℃ 1分
96℃ 10秒 ⌉
50℃ 5秒     ¦ ×25
60℃ 4分    ⌋
4℃ pause
シークエンス後、Forward sequenceおよびReverse SequenceをConexio社のAssign SBTソフトウェアで解析し、アリルを決定する。

＊タイピングの解析については理研・分子ウイルス学特別研究ユニットまでお問合せ下さい。